laporan praktikum mikrobiologi MIC

BAB I

DASAR TEORI

1.1       TEORI MIC

Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai MIC adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan mikroba. MIC dari sebuah antibiotika terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitivitas dari mikroba terhadap antibiotika. Nilai MIC berlawanan dengan sensitivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai MIC dari sebuah antibiotika, sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. MIC dari sebuah antibiotika terhadap spesies mikroba adalah rata-rata MIC terhadap seluruh strain dari spesies tersebut. Strain dari beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda dalam hal sensitivitasnya. Metode uji antimikrobial yang sering digunakan adalah metode Difusi Lempeng Agar. Uji ini dilakukan pada permukaan medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas saring yang berbentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah inkubasi diameter zona penghambatan diukur. Diameter zona pengambatan merupakan pengukuran MIC secara tidak langsung dari antibiotika terhadap mikroba. Sensitivitas klinik dari mikroba kemudian ditentukan dari tabel klasifikasi (Jawetz et al.,1996).

Pertumbuhan mikroorganisme dapat dikendalikan melalui proses fisik dan kimia. Pengendalian dapat berupa pembasmian dan penghambatan populasi mikroorganisme. Zat antimikrobial adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan dan metabolisme melalui mekanisme penghambatan pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikrobial terdiri dari antijamur dan antibakterial. Zat antibakterial adalah zat yang mengganggu pertumbuhan dan metabolisme melalui penghambatan pertumbuhan bakteri. Beberapa hal yang perlu dipertimbangkan dalam memilih zat antimikrobial kimiawi adalah :

1.      Jenis zat dan mikroorganisme.

Zat antimikrobial yang akan digunakan harus sesuai dengan jenis mikroorganismenya karena memiliki kerentanan yang berbeda-beda.

2.      Konsentrasi dan intensitas zat antimicrobial

Semakin tinggi konsentrasi zat antimikrobial yang digunakan, maka semakin tinggi pula daya kemampuannya dalam mengendalikan mikroorganisme.

3.      Jumlah organisme.

Semakin banyak mikroorganisme yang dihambat atau dibunuh, maka semakin lama waktu yang diperlukan untuk mengendalikannya.

4.      Suhu
Suhu yang optimal dapat menaikkan efektivitas zat antimicrobial

5.      Bahan organic

Bahan organik asing dapat menurunkan efektivitas zat antimikrobial dengan cara menginaktifkan bahan tersebut atau melindungi mikroorganisme. Hal tersebut karena penggabungan zat dan bahan organik asing membentuk zat antimikrobial yang berupa endapan sehingga zat antimikrobial tidak lagi mengikat mikroorganisme. Akumulasi bahan organik terjadi pada permukaan sel mikroorganisme sehingga menjadi pelindung yang mengganggu kontak antara zat antimikrobial dengan mikroorganisme (Boyd, 1980).

Faktor lain yang mempengaruhi adalah dosis antibiotika yang diberikan. Beberapa masalah adalah konsentrasi dari zat kemoterapi dalam jaringan, dimana menghasilkan konsentrasi obat lain lebih besar atau lebih rendah daripada yang digunakan dalam laboratarium. Hal itu penting, sehingga level obat itu dapat dicapai dalam bermacam bagian tubuh dapat diketahui seperti halnya sensitivitas relative dari bakteri pathogen. Sensitifitas relatif disebut dengan Minimum Inhibitory Concentration atau MIC (Pelczar,1988).

Prinsip dasar metode ini adalah dengan cara memberikan bakteri / kuman uji dengan kepadatan tertentu kepada bahan antibakteri yang akan diuji pada konsentrasi yang semakin kecil. Kepekaan bahan uji terhadap bahan anti-bakteri ditentukan dengan pengamatan secara makroskopis setelah  masa inkubasi berakhir yaitu dengan melihat ada tidaknya pertumbuhan koloni kuman / bakteri uji dalam tabung ( medium cair ) yang ditandai keruhnya medium cair yang dipakai (Pelczar, 1988).

Metode ini digunakan untuk menentukan kadar hambat minimal (KHM) suatu senyawa anti-bakteri. Pada metode ini digunakan erlenmeyer yang diisi media cair dan sejumlah tertentu bakteri yang diuji, kemudian masing-masing erlenmeyer diisi dengan senyawa yang diuji. Erlenmeyer-erlenmeyer tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam, untuk selanjutnya diamati turbidansi atau kekeruhannya dengan menggunakan  spektrofotometer UV-VIS. Konsentrasi terendah senyawa yang memberikan hasil biakan yang mulai tampak jernih merupakan Kadar Hambat Minimal senyawa tersebut. Metode Tube Dilution Test mempunyai keuntungan karena dapat menguji daya bakteriostatik dan bakterisidal sekaligus, namun metode ini hanya dapat menguji satu bahan antibakteri dalam satu kali kegiatan (Pelczar, 1988)

BAB II

PRINSIP DAN TUJUAN

2.1       PRINSIP KERJA

Metode pengenceran konsentrasi

Adanya kekeruhan yang menunjukan adanya pertumbuhan bakteri yang masih resisten

2.2       TUJUAN PRAKTIKUM

Menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) suatu sediaan uji terhadap baktei gram positif maupun gram negative, dengan menggunakan metoda MIC cair atau MIC padat.

BAB III

PROSEDUR PERCOBAAN

3.1       LANGKAH KERJA

1. METODA CAIR

1. Masukan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan dengan pelarut awalnya. Kemudian tambahkan pengencer akhir sampai sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukan kedalam labu ukur.
2. Rencanakn pengenceran dan lakukan perhitungan konsentrasi campuran pada masing-masing tabung besar dan tabung-tabung kecil.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam tabung-tabung reaksi besar.
4. Isi tabung reaksi kecil pertama dengan 1 ml NB double strength, sedangkan tabung-tabung reaksi selanjutnya dengan 1 ml NB biasa.
5. Pipet 1 ml hasil pengenceran terakhir kedalam tabung 1 berisi NB double strength, kocok ad homogeny
6. Pipet 1 ml hasil campuran dari tabung 1 ke tabung 2, kocok ad homogeny
7. Ulangi langkah tersebut sampai tabung terakhir. Buang 1 ml campuran dari tabung terakhir
8. Tambahkan 1 osse bakteri kedalam masing-masing tabung kecil, kocok sampai homogeny.
9. Ulangi langkah 3 sampai 7 untuk bakteri yang lain
10. Buat 1 kontrol positif dan 1 kontrol negative. Control positif terdiri dari 1 ml NB dan 1 osse bakteri (salah satu saja). Control negative hanya berisi 1 ml NB
11. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 37⁰ C selama 18-24 jam. Amati kekeruhan yang terjadi, bandingkan dengan control positif dan negative
12. Tentukan dimana MIC nya. MIC terletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak menunjukan adanya pertumbuhan bakteri (berwarna bening, sesuai dengan control negative) dan konsentrasi pertama yang menunjukan adanya pertumbuhan bakteri (berwana keruh).

      Skema Langakah Kerja Metoda MIC Cair

                

Gambar 1. Pengenceran Amoxycillin   Gambar 2. Pengenceran NB

             

Gambar 3. Control Positif                    Gambar 4. Control Negatif

                          

Gambar 5. Pemijaran                           Gambar 6. Bakteri 10⁹

2. METODA MIC PADAT

1.      Masukan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan dengan pelarut awalnya kemudian tambahkan pengencer akhir sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukan kedalam labu ukur.

2.      Rencanakan pengnceran dan hitung konsentrasi campuran pada masing-masing tabung besar dan cawan-cawan petri.

3.      Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam tabung-tabung reaksi besar.

4.      Bagi permukaan dasar cawan menjadi area-area sama besar. Beri label nama bakteri yang akan digunakan pada setiap area.

5.      Pipet 1 ml masing-masing pengenceran kedalam cawan-cawan petri. Tambahkan 18 ml NA cair bersuhu 40-50⁰ C, goyangkan beberapa saat, lalu diamkan sampai membeku.

6.      Goreskan masing-masing bakteri pada area yang terpisah dengan menggunakan osse. Buat control positif yang terdiri dari 20 ml NA dalam cawan petri, yang digores oleh bakteri-bakteri yang digunakan di area yang terpisah.

7.      Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 37⁰ selama 18-24 jam. Amati pertumbuhan bakteri dari koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi koloni-koloni tersebut dengan control positif.

8.      Tentukan dimana MICnya. MICterletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri dan konseentrasi pertama yang menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri.

3.2       PERHITUNGAN KONSENTRASI PENGENCERAN

v  Perhitungan Metode MIC cair

Rumus pengenceran :

V1. M1 = V2. M2

Perhitungan :

Tabung ke-1 :            V1.M1 = V2. M2

                                    2 ml . 2500 μg = 10 . M2

                                    M2 = 5000/10

                                    M2 = 500 μg

Tabung ke-2 :              V1. M1 = V2 . M2

                                    5 ml . 500 μg = 10 ml. M2     

                                    M2 = 2500/10

                                    M2 = 250 μg

                        Tabung ke-3 ;              V1. M1 = V2.  M2

                                                            5 ml. 250 μg = 10 ml. M2      

                                                            M2 = 1250/10

                                                            M2 = 125 μg

                        Tabung ke-4 ;              V1. M1 = V2.  M2

                                                            5 ml. 125 μg = 10 ml. M2

                                                            M2 = 625/10  

                                                            M2 = 62,5 μg

                        Tabung ke-5 ;              VI. M1 = V2. M2

                                                            5  ml. 62,5 μg = 10 ml. M2    

                                                            M2 = 312,5/10

                                                            M2 = 31,25 μg

                        Tabung ke-6 :              VI. M1 = V2 . M2

                                                            5 ml. 31,25 μg = 10 ml. M2

                                                            M2 = 156.25 /10

                                                            M2 = 15.625 μg

                        Tabung ke-7 :              VI. MI = V2. M2

                                                            5 ml. 15.625 μg = 10 ml. M2

                                                            M2 = 78.125 /10

                                                            M2 = 7.8125 μg

                        Tabung ke-8 :              VI. M1 = V2. M2

                                                            5 ml. 7.8125 μg = 10 ml. M2

                                                            M2 = 39.0625/10

                                                            M2= 3.90625 μg

v  Perhitungan  Metoda MIC Padat

Pengenceran Amoxicillin 500 mg

Kelarutan dalam air : 3.430 mg/L

500 mg Amoxicillin dilarutkan dengan 200 ml air

Larutan Amoxicillin    = 500 mg / 200 ml

                        = 250 mg / 100 ml

                        = 2.500 mg / L

                        = 2500μg / ml

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1       HASIL PENGAMATAN

1. Tabel Hasil Pengamatan Metoda MIC Cair

PENGAMATAN			TABUNG REAKSI
	1	2	3	4	5	6	7	8
KEKERUHAN	+	-	+	-	+	+	-	-

2.      Tabel Hasil Pengamtan Metoda MIC Padat

PENGAMATAN	CAWAN PETRI
	1	2	3	4	5	6	7	8	CONTROL POSITIF
PERTUMBUHAN BAKTERI	-	+	+	+	+	+	+	+	-

3. Foto Hasil Pengamatan Metoda MIC Cair

                 

Gamabar 1.  NB 1 + C.P                     Gambar 2. NB 2 + C.P

                        

Gamabar 3.  NB 4 + C.P                     Gambar 4. NB 5 + C.P

                  

Gamabar 5.  NB 6 + C.P                     Gambar 6. NB 7+ C.P

Gamabar 7.  NB 8 + C.P

Keterangan :

C.P = Control Positif

4.      Foto Hasil Pengamatan Metoda MIC Padat

                          

Gambar 1. cawan petri 1                     Gambar 2. cawan petri 2

                   

Gambar 3. Cawan Petri 3                    Gambar 4. Cawan petri 4

                  

Gambar 5. Cawan petri 5                    Gambar 6. Cawan petri 6

                   

Gambar 7. Cawan petri 7                    Gambar 8. Cawan petri 8

                   

Gambar 9. Cawan petri 9                    Gambar 10. Na +bakteri

4.2     PEMBAHASAN

1)      Pembahasan MIC Cair

Praktikum metode MIC cair ini dilakukan untuk menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) satu sediaan uji terhadap bakteri. Sediaan antibiotik yang digunakan dalam percobaan ini adalah Amoxicillin. MIC adalah konsentrasi antibiotik terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat. MIC biasanya dapat dilihat pada, tabung reaksi  bening terakhir dan tabung reaksi sebelum keruh pertama.

Sebelum melakukan percobaan ini, semua peralatan percobaan harus disterilisasikan untuk memastikan peralatan benar-benar bersih dan hasil percobaan tidak dipengaruhi oleh mikroba yang mungkin terdapat di atas permukaan peralatan. Media yang digunakan adalah Nutrient Broth yang bertujuan untuk memberi tambahan nutrisi. Bakteri yang  digunakan yaitu Escherichia Coli.

Percobaan dimulakan dengan mengencerkan larutan antibiotika Amoxicillin yang sudah sediakan di labrotorium. 1 ml larutan amoxicillin ditambahkan dengan 8 ml aquadest steril kedalam tabung reaksi . Diteruskan pula dengan pengenceran bertingkat. Ini dilakukan ke dalam enam tabung reaksi kecil. Tabung reaksi kecil (1) diisikan dengan 1ml  Nutrient Broth double strength dan yang lainnya diisi dengan 1ml Nutrient Broth biasa. Ini adalah karena Nutrient Broth double strength terdapat kandungan nutrisi dua kali ganda daripada Nutrient Broth biasa. Maka ini dapat membedakan efektivitas antibiotik terhadap bakteri yang terdapat dalam dua Nutrient Broth tersebut. 1ml antibiotik yang berkonsentrasi 5000 mg/ml dipipet ke dalam tabung reaksi kecil (1) dan (2) masing-masing. Ini membuatkan tabung reaksi (1) dan (2) berkonsentrasi 500 mg/ml. kemudian dari tabung reaksi kecil (2) dilakukan pengenceran bertingkat amoxicillin ke semua tabung reaksi seterusnya.

Volum pada tabung reaksi kecil terakhir ini harus dibuang 1ml karena untuk membandingkan daya kerja satu antibiotik, setiap tabung harus mendapatkan perlakuan yang sama, baik volume larutan antibiotik, banyak suspensi bakteri dan juga konsentrasi dari suspensi bakteri tersebut.

Setelah tercampur sebelas tabung reaksi kecil dimasukkan 1 ose bakteri Esherichia Coli dengan kuantiti yang sama banyak dan dikocok sampai homogen. Ose harus difiksasi terlebih dahulu sebelum pengambilan bakteri supaya ose steril dan dipengaruhi oleh bakteri udara sekeliling. Setelah difiksasi, ose tidak boleh langsung dicelupkan pada media tetapi harus tunggu sementara supaya bakteri tidak mati  karena ose yang terlalu panas. Selain itu, sebelum diambil, suspensi bakteri harus dihomogenkan terlebih dahulu karena kemungkinan suspense bakteri berkumpul pada bahagian bawah tabung reaksi.

Setiap tabung reaksi kecil yang berisi bakteri diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Ini penting untuk menunggu bakteri dan berkembang pada waktu yang diinginkan (Fasa log bakteri), dimana maksimal. Tetapi sebaiknya hasil diamati setelah 24 jam karena tidak seperti pada NA, nutrisi ada pada NB jauh lebih sedikit. Apabila lebih dari 24 jam dikhawatirkan bakteri tersebut mengalami fasa kematian. Segala perlakuan harus dilakukan secara aseptis yaitu dekat dengan api agar bakteri lain yang berasal dari udara yang masuk ke dalam tabung reaksi akan menyebabkan terganggunya hasil pengamatan.

Menurut hasil praktikum kami tabung reaksi yang pertama memberikan hasil positif ditunjukkan dengan larutan keruh karena pertumbuhan bakteri tidak dihambat atau sedikit saja yang dihambat oleh antibiotika tersebut yang ditandai dengan tanda (+), kemudian tabung reaksi kedua menunjukan hasil negative yaitu ditandai dengan (-). Pada tabung reaksi kedua dan ketiga hasilnya sama seperti pada tabung reaksi ke satu dan kedua, selanjutnya tabung reaksi ke 5 dan ke 6 hasilnya posiif (+), selanjutnya tabung reaksi ke 7 hasilnya adalah negative dan yang terakhir hasilnya yaitu positive. Kami sedikit ragu dengan hasil pengamatan yang kami peroleh apakah percobaan ini berhasil atau tidak.

2)      Pembahasan Metoda MIC Padat

Percobaan ini menguji Minimum Inhibitor Concentracy (MIC) dari antibiotik amoxicillin terhadap bakteri Eschericia coli. MIC adalah konsentrasi terkecil zat antimikroba yang masih mempunyai daya hambat atau mulai bekerja pada mikroorganisme tertentu atau dengan kata lain konsentrasi terendah antibiotik untuk membunuh bakteri di dalam cawan petri atau in vitro.

Sediaan yang diuji dalam percobaan ini adalah amoxicillin. Dalam melarutkan pada labu ukur, harus diperhatikan ketepatan dalam menambahkan air sampai tanda batas, jika pelarut melebihi tanda batas maka konsentrasi amoxicillin akan berkurang. Begitu juga sebaliknya jika pelarut yang ditambahkan kurang dari tanda batas,konsentrasi amoxicillin akan lebih besar dari yang diperhitungkan.

Sebelum memulai praktikum, dilakukan perencanaan pengenceran dan perhitungan konsentrasi. Pertama-tama dilakukan pengenceran sesuai dengan perhitungan. Setelah dilakukan pengenceran pada tabung, dilakukan pembagian pada permukaan dasar cawan petri 9 buah dan salah satu cawan sebagai kontrol positif. Setiap cawan ini diberi label untuk mempermudah dalam pengamatan.

Pada penggunan cawan petri, jangan dibiarkan dalam kondisi terbuka, agar isi cawan tidak terkontaminasi oleh udara luar. Kemudian setiap tabung reaksi kecil yang telah dilakukan pengenceran, yaitu dengan konsentrasi 500 μg (tabung ke 1), 250 μg (tabung ke 2), 125 μg (tabung ke 3), 62,5 μg (tabung ke 4), 31,25 μg (tabung ke 5), 15,625 μg (tabung ke 6), 7,812 μg (tabung ke 7), 3,906 μg (tabung ke 8) diambil 1 ml dari masing-masing tabung dan dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri.

Proses ini dilakukan dalam keadaan aseptik untuk menghindari kontaminasi dari udara luar. Lalu ditambah dengan 18 ml nutrien agar (NA) cair bersuhu 40-50 ºC. Nutrien agar harus tetap dalam suhu tersebut karena jika di bawah suhu tersebut, nutrien agar akan nmembeku dan tidak bisa dituang. Pada saat penuangan juga harus dilakukan dalam keadaan aseptik. Setelah ditambahkan nutrien agar, cawan petri tersebut segera digoyang perlahan pada permukaan yang datar, untuk mencegah nutrien agar membeku lebih dulu sebelum bercampur sempurna dengan antibiotik. Setelah itu, didiamkan hingga membeku. Medium ini harus tercampur sempurna agar pertumbuhan pada bakteri yang dapat tumbuh dapat tersebar merata.

Setelah nutrien agar membeku, bakteri E.coli (10⁹) digoreskan pada medium menggunakan osse. Penggoresan harus dilakukan secara hati-hati, supaya medium padat tidak rusak, karena dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri yang dapat tumbuh. Setelah itu, cawan petri ini diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Proses inkubasi dilakukan untuk menciptakan suasana ideal dalam proses pembiakan bakteri sehingga proses dapat berlangsung maksimal. Waktu 24 jam ditentukan karena pada rentang waktu tersebut bakteri berada pada fase perkembangbiakan optimal.

Setelah diinkubasi, dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri dalam cawan petri. Pada bagian yang ditanam oleh bakteri E.coli (10⁹) memberikan hasil yang positif  pada semua konsentrasi antibiotik. Hal ini menunjukkan bahwa berbagai konsentrasi antibiotik tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri. terlihat pertumbuhan pada konsentrasi tersebut.

Pada MIC padat, satu sampel antibiotik dapat mengidentifikasi sekaligus lebih dari satu bakteri, sedangkan pada MIC cair tidak bisa demikian yaitu satu antibiotik digunakan untuk satu bakteri. MIC terletak pada cawan petri bening terakhir atau sebelum cawan petri ditumbuhi bakteri pertama. Hasil percobaan ini dicatat dan sebagai patokan dalam menentukan hasil pengamatan, sampel uji dibandingkan dengan kontrol positif. Jika ada pertumbuhan, bakteri yang terdapat di dalam cawan hidup (hasil positif). Sebaliknya, jika tidak ada pertumbuhan (bening) berarti bakteri yang terdapat di dalamnya mati (hasil negatif).

BAB V

PENUTUP

5.1       KESIMPULAN

a.       Dalam percobaan ini, perbedaan pengaruh konsentrasi antibiotik seharusnya memberikan hasil pertumbuhan koloni bakteri yang berbeda. Tetapi disebabkan konsentrasi antibiotik yang digunakan terlalu kecil dan tidak sesuai maka penentuan MIC dari suatu antibiotik itu tidak dapat diketahui.

b.      Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari antibiotik amoxicillin terhadap bakteri Eschericia coli adalah 3,906 µg oleh karena itu pada kesemua cawan petri ditumbuhi koloni-koloni bakteri.

DAFTAR PUSTAKA

Hargono Yus, C.Y. M.Sc. modul praktikum mikrobiologi farmasi. universitas Al- ghifari. Bandung

Anne Ahira. 2009. Antibiotika

Boyd, Robert F., 1988. General Microbiology. Second Edition. Times Mirror/Mosby College Publishing.

Jawetz et. al. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. EGC:Jakarta.

Pelczar, Michael, J., dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi I. UI  Press, Jakarta.

Ratu Balqis. 2008. Staphylococcus aureus.http://queenofsheeba.wordpress.com /2008/07/22/bakteri-staphylococcus-aureus/ [ diakses pada 26 Maret 2011]

Eka Yuliani, Switiani. Maret 2013. Kadar Hambat Minimal Antibiotik

Tersedia : Switianiekayuliani.blogspot.co.id/2013/03/kadar-hambat-minimal-antibiotik_8963.html (online) diakses 27 September 2016

Anonymous. 2007. Antibiotic Resistance. 

Tersedia : http://en.wikipedia.org/wiki/Antibiotic_resistance (online) diakses 26 September 2016

Anonymous. 2007. MinimumInhibitory Concentration.

Tersedia : http://en.wikipedia.org/wiki/Minimum_inhibitory_concentration (online) diakses 26 September 2016